PLVX-Puro质粒包病毒流程

PLVX-Puro质粒包病毒流程

一、实验流程图解

    A[Day 1：293T细胞铺板] --> B[Day 2：三质粒共转染]

    B --> C[Day 3-4：病毒收集]

    C --> D[靶细胞预实验]

    D --> E[正式感染+嘌呤霉素筛选]

• 关键操作步骤图解

1. 质粒结构特征（PLVX-Puro核心元件）

5'LTR ──► CMV启动子 ──► MCS（目的基因）──► IRES  ──► PuroR ──► WPRE ──► 3'LTR

              │               │                     │

          启动表达        插入靶基因            抗性筛选标记

2. 三质粒共转染（Day 2关键操作）

图解步骤：

       质粒混合液                 沉淀形成                  细胞添加

      ┌───────────┐       ┌───────────────────┐       ┌───────────┐

      │ PLVX-Puro │      │  CaCl₂ + 2×HBS   │      │  293T细胞  │

      │  psPAX2   ├───混合──► 室温静置20min   ───滴加──► 培养皿    │

      │  pMD2.G   │      │ 乳白色微沉淀     │      │ (70%密度) │

      └───────────┘      └───────────────────┘      └───────────┘

         比例4:3:1           pH严格7.05-7.10         轻柔摇匀

3. 病毒收集与处理（Day 3-4）

    收集上清                    过滤除杂                    分装储存

┌───────────────┐      ┌───────────────────┐      ┌─────────────┐

│ 移液器吸取培养液 │───►│ 0.45μm PVDF滤器   │───►│ -80℃冻存管   │

│ (避开细胞层)    │     │ 预冷PBS润洗       │     │ 加10% FBS    │

└───────────────┘      └───────────────────┘      └─────────────┘

      48h & 72h                 无菌操作               避免反复冻融

4. 靶细胞感染（离心法提升效率）

 细胞铺板         病毒混合液添加          离心感染          换液培养

┌─────────┐      ┌─────────────┐       ┌──────────┐      ┌─────────┐

│ 30%密度  │───►│ 病毒上清      ├───►│ 1000g     │───►│ 24h后    │

│ 6孔板    │     │ Polybrene     │     │ 32℃, 90min│     │ 换完全培养基│

└─────────┘     │ (终浓度8μg/mL)│      └──────────┘     └─────────┘

稳转株筛选流程

嘌呤霉素筛选关键点

         预实验                    正式筛选                维持培养

      ┌─────────────┐       ┌──────────────────┐       ┌───────────┐

      │ 浓度梯度测试 │       │ 感染后48h加药     │       │ 半浓度维持 │

      │ (1-10μg/mL) ├───确定──► 每日观察死亡情况 ├───►│ (如2→1μg/mL)│

      │ 72hr内100%死亡│       │ 持续3-7天        │       │ 冻存早期代次│

      └─────────────┘       └─────────────────

四、验证实验设计

| 验证方法       | 检测目标                      |预期结果                  |

| Western Blot      | 目的蛋白表达（Flag/HA标签） | 特定分子量条带                |

| 流式细胞术      | GFP/mCherry阳性率          | >70%感染效率                 |

| qPCR          | 基因组整合拷贝数            | MOI=1时≈1拷贝/细胞           |

核心注意事项

1. 生物安全

     所有操作在Ⅱ级生物安全柜进行，废弃物经121℃高压灭菌30分钟  

2. 细胞状态

   293T细胞传代≤30次，支原体检测每月1次（*图6：支原体污染对比图*）  

   ! 正常细胞：贴壁均匀，边缘清晰

   ! 污染细胞：颗粒增多，部分漂浮

3. 表达稳定性  

 - 连续传代后可能出现沉默，添加组蛋白去乙酰化酶抑制剂（如TSA）可缓解