真核单质粒CRISPR敲除步骤-参考pLentiCRISPR V2（#52961）

真核单质粒CRISPR敲除步骤-参考pLentiCRISPR V2（#52961）

pLentiCRISPRv2 (#52961) CRISPR基因敲除实验

一、载体

单载体一体化系统：U6驱动sgRNA、EFS启动Cas9、P2A-Puro嘌呤霉素筛选标记；BsmBI酶切插入sgRNA；配套包装质粒：psPAX2、pMD2.G（三质粒慢病毒包装） 。

（1）：sgRNA靶点设计与oligo合成，sgRNA设计规则：

1. 靶点选基因靠前外显子（易移码敲除），20bp引导序列，3'端匹配NGG PAM；

2. U6启动子要求5'首碱基为G，若靶点首字母非G，前端额外加1个G；

3. 至少设计2条独立sgRNA，降低脱靶、保证敲除阳性；工具：CRISPick、CHOPCHOP。

（2）. Oligo序列格式（载体专用）

    正向Oligo（Sense）：5’-CACCG+20bp靶点序列-3’

    反向Oligo（Antisense）：5’-AAAC+20bp靶点反向互补+C-3’

示例：靶点20bp=ATCGGCTAGCATGTTACGCA

F: CACCGATCGGCTAGCATGTTACGCA

R: AAACTGCGTAACATGCTAGCCGATC

（3）： 引物稀释

干粉离心后，无菌水稀释至100 μM备用。

 载体酶切（BsmBI）+胶回收骨架

A: 50 μL酶切体系

B: 37 ℃孵育1.5 h；琼脂糖电泳分离：

- 大片段≈13 kb（载体骨架，回收）

- 小条带≈2 kb filler片段（丢弃，否则高假阳性）

C :胶回收试剂盒纯化骨架，EB洗脱，测浓度备用。

(3)：Oligo磷酸化退火

10 μL退火磷酸化体系 ：

1 μL 100 μM F oligo + 1 μL 100 μM R oligo + 1 μL 10×T4连接缓冲液 + 6.5 μL水 + 0.5 μL T4 PNK

           程序：37 ℃ 30 min（磷酸化）→95 ℃ 5 min → 以5 ℃/min缓慢降温至25 ℃

          退火产物1:200无菌水稀释，得到工作液。

(4)：连接重组质粒:

      11 μL连接体系：

50 ng BsmBI切后载体骨架 + 1 μL稀释后退火双链 + 5 μL 2×Quick Ligase Buffer + 补水至10 μL + 1 μL Quick T4连接酶,室温静置10 min。

(5)：转化、阳性克隆鉴定

      1. 转化Stbl3感受态（慢病毒载体专用，防止重组突变）：

       冰浴30 min → 42 ℃热激30 s → 冰浴2 min；加900 μL无抗LB，37 ℃摇45 min；

2. 6000 rpm离心，留100 μL重悬，涂布氨苄青霉素LB平板（100 μg/mL Amp）；37 ℃过夜；

       3. 挑单菌落，菌落PCR（U6通用引物），阳性克隆摇菌提质粒；

      4. 测序验证（U6-F测序引物），确认sgRNA序列无突变；质粒-20 ℃保存。

 (6)：慢病毒包装（HEK293T细胞）

      1. 铺细胞:6 cm培养皿铺293T，转染当日汇合度60%，无支原体污染。

     2. 三质粒转染比例

     pLentiCRISPRv2重组质粒 : psPAX2 : pMD2.G = 9 : 6 : 3（质量比）

    转染试剂：PEI或Lipofectamine 3000；按说明书配制转染复合物滴加细胞。

    3. 收病毒

       转染后48 h：收集上清（含病毒），4 ℃保存；补新鲜完全培养基；

转染后72 h：再次收集上清，合并两次病毒液；

 3000 rpm离心10 min去除细胞碎片，0.45 μm滤器过滤除菌；

(7)：目标细胞慢病毒感染+嘌呤霉素筛选

    1. 目标细胞铺板（6孔板，汇合度40%–50%）；

2. 病毒上清+8 μg/mL Polybrene（提高感染效率），替换原有培养基；

3. 感染24 h后更换新鲜完全培养基；

4. 感染48 h后加嘌呤霉素筛选：

提前做预实验确定最低致死浓度（多数细胞1–2 μg/mL）；持续筛选3–7天，未感染细胞全部死亡，存活细胞为稳定整合Cas9+sgRNA的阳性池。

（8）：敲除细胞鉴定

   1. 基因组水平（T7E1酶切/测序）

      收集细胞提基因组，靶点上下游设计引物PCR扩增靶片段；

T7E1酶切：杂合编辑样本会出现酶切小条带，判断剪切效率，测序。

   2. 蛋白水平（WB）

      提取总蛋白，靶蛋白抗体检测，对比阴性对照组（空载体lentiCRISPRv2感染细胞），条带消失/显著减弱即敲除成功。

   3. 单克隆细胞株分选（纯KO细胞）

阳性细胞池消化，梯度稀释铺96孔板（单细胞每孔）；单克隆扩增后重复WB/测序验证，获得纯合敲除细胞系。

 对照组：

1. 空白细胞组：未感染病毒；

2. 阴性病毒对照组：空载pLentiCRISPRv2（无sgRNA）包装病毒感染细胞，排除载体、嘌呤霉素、Cas9本身的细胞毒性。

 注意事项

1. 慢病毒载体必须用Stbl3菌株扩增，DH5α易发生片段缺失；

2. BsmBI消化后必须胶回收，残留2kb filler会大量假阳性；

3. 嘌呤霉素筛选时间充足，避免杂细胞残留；

4. 至少2条独立sgRNA同时实验，表型一致才能排除脱靶干扰；

5. 所有含慢病毒上清操作严格生物安全二级防护。